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【摘要】【目的】为探讨姜黄素(curcumin)对胰岛素抵抗的治疗作用及其机制。【方法】利用胰岛素抵抗的小鼠模型,观察姜黄素对小鼠胰岛素抵抗的水平、转录因子I-?资B?琢、循环细胞因子的变化。【结果】①姜黄素能抑制TNF?琢刺激Fao细胞NF-?资B激活;②姜黄素治疗后小鼠的空腹血糖水平没有明显下降,但空腹胰岛素的水平下降约30,葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降;③循环中TNF?琢[(34.5±3.4)pg/mLvs(31.3±1.1)pg/mL]水平没有明显改变,而IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mLvs(|15.6±1.1)pg/mL]和IL-6[(72.1±9.8)pg/mLvs(47.2±5.3)pg/mL]水平明显被抑制;④胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高,而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。【结论】姜黄素能提高小鼠胰岛素敏感性,有治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗的作用。【关键词】姜黄素;NF-?资B;胰岛素;抵抗)姜黄(CurcumalongaL.)是常用中药,临床上用于活血、行气、通经、止痛。姜黄|素(curcumin)是一种黄色色素,从姜黄中提取得到的主要有效成分。近年来,大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生理和药理作用[1-4]。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂,并有结果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应,而且提高受体动物的存活率[5,6]。在实验研究中,炎症又与胰岛素抵抗密切相关[7,8]。炎症被证实是代谢综合征的共同土壤,联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗,本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型,并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机制作初步探讨|。1材料与方法1.1材料1.1.1姜黄素购于印度亚洲公司(纯度99)。1.1.2动物Obob雄性小鼠16只,8周龄、空腹体质量(33~38g),购自南京国家模式动物中心,用含脂肪6.4的标准饲料饲养,实验前1周纪录小鼠的饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。1.1.3FAO细胞购自TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)。1.1.4试剂IR、IRS-1、AKT、P85多克隆抗体由StevenShoelson实验室(JoslinDiabetesCenter,Harvard)提|供。FBSTNF?琢、胰岛素购自Sigma,St.LouisUSA,I-?资B?琢抗体,IKK?酌抗体,购于SantaCruz,CA,GST-I-?资B(1-54)底物由BostonBiologicals,Wellesley,MA合成。1.2方法1.2.1体外细胞实验FAO细胞使用培养液DMEM(购自Gibco公司),细胞置于37℃,5CO2的培养箱中培养。在10cm培养皿用10mLDMEM+10FBS含有高浓度葡萄糖(25mmol/L)的培养液中培养至80重叠率,经5mL0.1BSA孵育16h后接受不同浓度(0~|40umol/L)
1的姜黄素预处理,然后接受鼠TNF?琢10nmol/L刺激处理,于20min后用预冷的PBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆,备用,I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20min内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。1.2.2动物实验利用食物参入法制成含2姜黄素的颗粒饲料(LabDiets,5008),低温保存。动物饲养环境为中央通气,层流环境,恒温(23℃)、恒湿,12h明暗光照循环,24h随意饮食环境.动物购入后第5天开始接受口服葡萄糖耐量试验,并留取空|腹血浆作血浆胰岛素水平,和其它循环因子的检查。在验证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组,并接受姜黄素治疗,对照组用颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量,每3周测量空腹血糖并留取空腹血浆1次,第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆。试验后继续接受姜黄素治疗,第7周于空腹状态下接受5U/kg胰岛素富强注射,注射后5min整,用断颈法迅速处死动物,留取肝脏经液氮过渡后在-80℃低温冰箱保存,作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查用LincoResearch的Lumine|x试剂盒并采用Luminex200监测结果。1.2.3免疫印迹细胞或组织裂解液(30mmol/LHepes,150mmol/LNaCl,1TritonX-100,pH7.4。蛋白酶抑制剂由1mmol/LPMSF,3?滋mol/Laprotinin,5?滋mol/Lpepstatin,10?滋mol/Lleupeptin,25mmol/LBenzamidin,2mmol/LNa-vanadate,5mmol/L?茁-glycerolphosphate,10mmol/LNaF,1mmol/LAmmoniumMolybd|ate,30mmol/Ltetrasodiumpyrophosphate,5mmol/LEGTA)裂解细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(6),蛋白加热变性后每孔加30?滋g,电转移仪将蛋白转到PVDF膜。5脱脂奶粉TBS-T缓冲液洗膜,加一抗,4℃孵育过夜,TBS-T缓冲液洗膜,加过氧化物酶标记的IgG抗体(购自AmershamUSA),室温1h,TBS-T缓冲液洗膜,加ECL1min,暗室显影2~3min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。1.2.4统计学分析采用t检验。2结果1.1姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关|系Fao细胞在10cm2培养皿用10mL在10FBS+DMEM含有高浓度葡萄糖的培养液中培养至80重叠,经5mL0.1BSA孵育16h后接受姜黄素预处理:剂量关系用梯度浓度如图1所示,时效曲线用30μmol/L。预处理后接受鼠TNF10nmol/L刺激处理,于20min后用预冷的FBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆
