免疫细胞功能检测技术

第十五章　免疫细胞功能检测技术　　免疫细胞是指参与机体免疫应答的细胞，大致可分为两类，一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显示出特异性应答的功能，主要指淋巴细胞群，包括T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞等；另一类能捕获抗原，处理抗原，以一定方式提呈给淋巴细胞或表现其他免疫功能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。测定这些细胞功能可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。第一节　淋巴细胞的功能检测　　淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。　　体内试验主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；　　体外试验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂|原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。　　一、T细胞功能检测　　T细胞具有多种免疫生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原或丝裂原刺激产生增殖反应及产生各种细胞因子。据此，建立了一系列检测T细胞功能的体内和体外试验。　　（一）T细胞增殖试验　　1.原理：T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞增殖，并转化为淋巴母细胞。因此，淋巴细胞增殖反应又称淋巴母细胞转化。　　2.刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）和美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等。　　3.方法学：检测T|细胞增殖反应的方法有：　　（1）形态学检查法：运用普通光学显微镜，简便易行。缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。　　（2）3H-TdR掺入法：敏感性高，客观性强，重复性好，但需一定设备条件，及存在放射性核素污染问题。　　（3）MTT比色法：本方法的敏感性虽不及3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。较常采用。　　（二）T细胞分泌功能测定　　体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后，分泌各种细胞因子，可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术通过对于T细胞分泌细胞因子的含量、生物学活性和基因表达水平，以反映T细胞功能。　　（三）T细胞介|导的细胞毒试验　　常选用可传代的已建株的人肿瘤细胞，与待检淋巴细胞混合，观察肿瘤细胞杀伤的情况。是评价机体细胞免疫水平的常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。最新各类医学考试课程联系QQ58441453

1　　（四）体内实验　　正常机体对某种特殊抗原建立了细胞免疫后，如用相同的抗原做皮肤试验，常可出现阳性的迟发型超敏反应。目前临床上常用于诊断某些病原微生物感染（结核、麻风等）和细胞免疫缺陷等疾病，也常用于观察细胞免疫功能在治疗过程中的变化及判断预后等。　　1.特异性抗原皮肤试验：常用的特异性抗原皮肤试验为结核菌素皮肤试验。其他|皮试抗原还有白色念珠菌素、皮肤毛癣菌素、腮腺炎病毒等。受试者对所试抗原过去的致敏情况直接影响试验结果。若受试者从未接触过该抗原，则不会出现阳性反应，因此阴性者也不一定表明细胞免疫功能低下。为避免判断错误，往往需用两种以上抗原进行皮试，综合判断结果。　　2.PHA皮肤试验：将定量PHA注射到受试者前臂皮内，可非特异性刺激T细胞发生母细胞转化，呈现以单个核细胞浸润为主的炎性反应。PHA皮肤试验敏感性高，比较安全可靠，临床常用于检测机体的细胞免疫水平。　　二、B细胞功能检测　　B细胞主要产生Ig参与机体体液免疫应答，B细胞功能低下或缺乏者对外源性抗原刺激的应答能力减弱或缺陷，特异性抗|体产生减少或缺如。因此，B细胞功能试验方法有受试者血清Ig含量检测和体外B细胞增殖和产生抗体能力检测等。　　（一）B细胞增殖试验：原理与T细胞增殖试验相同，但刺激物不同，小鼠B细胞可用细菌脂多糖（LPS）作为刺激物，人则用含SPA的金黄色葡萄球菌菌体及抗IgM抗体等刺激。　　（二）溶血空斑试验　　1.原理：将SRBC免疫的小鼠脾脏（或家兔淋巴结）制成单个细胞悬液，与SRBC在琼脂糖凝胶内混合后倾注于小平皿或玻片上。脾细胞中的抗体生成细胞释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下可将SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。每一个空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为|抗体形成细胞数。空斑大小表示抗体形成细胞产生抗体的多少。　　2.方法学　　（1）经典溶血空斑形成试验：用于检测实验动物抗体形成细胞的功能。可分为直接法和间接法。直接法所测到的细胞为IgM类抗体形成细胞，其他类型的Ig由于溶血效应较低，不能直接检测；间接法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体产生细胞所产生的IgG或IgA与抗Ig抗体结合成复合物,此时能活化补体导致溶血。上述直接法和间接法都只能检测抗RBC抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。　　（2）被动溶血空斑试验：是指抗体形成细胞产生的Ig与SRBC上的抗原结合，|在补体参与下出现溶血反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注平皿，温育1～3小时后，形成肉眼可见的溶血空斑。这种非红细胞抗体性溶血空斑试验可检测SRBC上抗原相应的抗体形成细胞，因此应用范围较广　　3.临床应用与评价：溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。最新各类医学考试课程联系QQ58441453

2　　（三）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）　　1.原理：用抗原包被固相载体，加入待检的抗体产生细胞，即可诱导抗体的分泌。分泌的抗体与包被抗原结合，在抗体分泌细胞周围形成抗|原抗体复合物，使细胞吸附于载体上，加入酶标记的第二抗体与细胞上的抗体结合，通过底物显色反应的深浅，可测定出生成的抗体量，并可在镜下计数着色的斑点形成细胞。　　2.应用与方法学评价　　该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。其优点是稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分