硬叶兜兰居群水平的ITS基因扩增与信息分析研究 园林艺术专业

硬叶兜兰居群水平的ITS基因扩增与信息分析摘要为优化兜兰ITS-PCR反应体系，以硬叶兜兰为试材，用改良的2×CTAB提取总的DNA，以10×PCRbuffer1ul、Mg2+1.25ul、dNTP1.2ul、引物0.25ul、Taq酶0.3ul、ddH2O3.45ul为基础，模板DNA为2ul(50ng/ul)，通过实验摸索PCR的最佳退火温度，优化反应体系，对硬叶兜兰进行核基因ITS间隔子扩增，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳在Bio-Rad凝胶成像系统筛选可行反应产物。反应产物经测序分析，目的基因片段大小在79|3-809bp,通过NBCI网上在线对比分析证实为硬叶兜兰的ITS基因，该基因与同属植物的同源性为90%-99%。关键词：硬叶兜兰；ITS间隔子扩增；反应体系

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3目录1前言21.1兜兰属植物的概况21.2兜兰属植物研究进展41.2.1兜兰属植物的繁殖方法41.2.2ITS技术在兰科植物中的运用61.3研究的目的及意义72材料与方法92.1材料收集与处理92.2DNA的提取92.3ITS-PCR反应体系的建立及确定引物退火温度102.3.1ITS-PCR反应体系的建立102.3.2确定引物退火温度112.|4产物的检测与数据分析112.5试剂与仪器113结果与分析123.1DNA质量检测结果123.2ITS-PCR反应体系133.3退火温度的确定133.4目的基因生物学信息133.5四个居群DNA序列变异情况16结论与讨论21参考文献22指导老师简介24致谢25

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51前言1.1兜兰属植物的概况兜兰,也称“女士拖鞋兰”、“仙履兰”,是兰科（Orchidaceae）兜兰属(Paphiopedilum)植物的统称。在拉丁语中，兜兰属名Paphiopedilum由爱神Paphos和鞋Pedilon组成。世界上大约有6|6种兜兰属植物。近年来，已发现10多个新物种，总数超过80种[1]。兜兰属于亚热带植物，主要分布于东南亚至喜马拉雅低地至中国西南部，仅有少数物种分布在新几内亚和所罗门群岛。中国是兜兰属植物的主产区之一，有18种，主要生长在西南各省和地区，华南地区分布很少[2]。大多数种类的分布范围很窄，并具有一定的区域特征。例如杏黄兜兰（Paphiopedilumarmeniacum）、硬叶兜兰（P.micranthum）、麻栗坡兜兰（P.malipoense）仅分布在热带过渡区的石灰岩山地中，而紫色兜兰具有更广泛的分布区域。|陈心启等人认为，已知品种的最原始的代表品种可能是麻栗坡兜兰，是一个从杓兰属向兜兰属演化的中间类型或过渡类型。在我国各省的分布情况：（1）云南有14种，占全国的77.8％，占世界的21.5％。其中：紫纹兜兰（P.purpuratum）、同色兜兰（P.concolor）、带叶兜兰（P.hirsutissimum）在云南全境都有分布；享利兜兰（P.henryanum）、巨瓣兜兰（P.bellatulum）、紫毛兜兰（P.villosum）主要分布于云南的东南部；飘带兜兰（P.parishii）、长瓣兜兰（P.dian|thum）、硬叶兜兰（P.micranthum）主要分布在云南南部；杏黄兜兰（P.armeniacum）和虎斑兜兰（P.markianum）主要分布于云南的西部；彩云兜兰（P.wardii）、波瓣兜兰（P.insigne）则分别分布于云南的西南部和西北部（2）贵州有7种，占全国的38．9％，主要有小叶兜兰（P.barbigerum）、带叶兜兰、白花兜兰（P.emersonii）、同色兜兰、麻栗坡兜兰、硬叶兜兰。（3）广西有9种，占全国的50％，主要有紫纹兜兰、卷萼兜兰、白花兜兰、紫毛兜兰、硬叶兜兰、带叶兜兰、同|色兜兰、小叶兜兰。（4）西藏、广东和海南各有1种，分别为秀丽兜兰（P.venustum）、卷萼兜兰、紫纹兜兰[3]。外国兜兰种类德氏兜兰(P.delenatii)、菲律宾兜兰(P.philippinense)、苏氏兜兰(P.sukhakulii)、韩氏兜兰(P.hangianum)

6等数十种兜兰属植物主要分布在马来西亚、印度尼西亚、泰国、越南等国家的石灰岩山地的石隙或林下的腐殖土中。其中韩氏兜兰和德氏兜兰未来在花卉育种上具有很大的潜力[4]。兜兰属花的形状非常奇特，唇瓣呈兜状，类似于一位欧洲少女的拖鞋;花萼背|后特别发达，具有艳丽的花纹图案。兜兰和其他兰花之间的区别在于两个可育雄蕊着生在蕊柱的两侧;背侧花萼扁圆形或倒心形，最显着的是在每个瓣中。因此，以其独特的魅力和许多优美的特征而受到世界花卉爱好者喜爱。杏黄兜兰和白花兜兰自从传入欧美后,获得近百个有关美国兰展的奖项,追捧至今未衰。硬叶兜兰更是曾勇夺世界兰展全场总冠军,惊艳兰坛。杏黄兜兰和硬叶兜兰被誉为“金童玉女”，是兰花中的瑰宝，备受世人的喜爱[5]。硬叶兜兰地生或半附生植物，地下具细长而横走的根状茎；根状茎直径2-3mm,具少数稍肉质而被毛的纤维根。叶基生，4-5|枚；叶片长圆形或舌状，革质坚硬，长5-15cm,宽1.5-2cm,先端钝，上面深绿色网状，背面具有密生的紫色斑点和龙骨状突起，基部收狭成叶柄状并相互重叠。花葶直立，长10-26cm，紫红色且具有深色斑点，被长柔毛，顶端具1花；花苞卵形或宽卵形，绿色而具有紫色斑点，长1-1.4cm，背面疏被长柔毛；花梗和子房长3.5-4.5cm，被长柔毛；花大，艳丽，中萼片与花瓣通常白色而有黄色晕和淡紫红色粗脉纹，唇瓣白色至浅粉红色，退化雄蕊黄色，具淡紫色斑点和短纹；中萼片卵形或宽卵形，长2-3cm，宽1.8-2.5cm，先端锐|尖，背面被长柔毛，具龙骨状突起；合萼片卵形或宽卵形，长2-2.8cm，宽1.8-2.8cm，先端钝或尖，背面被长柔毛，具2条稍钝的龙骨状突起；花瓣宽卵形，宽椭圆形或近圆形，长2.8-3.2cm，宽2.6-3.5cm，钝或浑圆形的先端，白色长柔毛在内表面的基部，背面多少短柔毛；唇瓣深囊状，卵状椭圆形近球形，长4.5-6.5cm，宽4.5-5.5cm，基部具